人参皂苷Rg3通过调节长非编码RNA HOX反义基因间(HOTAIR)表达抑制肝癌细胞增殖和侵袭

1.材料与方法

SMMC-7721、SK-Hep-1和HEK293T细胞购自ATCC，并在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中培养至细胞长满70~80%，在37°C和5%CO₂下进行实验。

细胞实验分为四组：对照组、人参皂苷Rg3组、HOTAIR过度表达组和人参皂苷Rg3+HOTAIR对照组。利用基因制药公司构建了HOTAIR过表达质粒和对照质粒。

采用qRT-PCR检测lncRNA-HOTAIR的mRNA表达。将HOTAIR过表达质粒转染到SMMC-7721和SK-Hep-1细胞中。此外，我们还采用MTT法检测转染细胞的增殖情况。用划痕法和跨孔法测定细胞的迁移和侵袭能力。此外，采用用蛋白印迹法检测蛋白水平。

所有实验数据均以平均值±标准偏差（SD）表示，并使用GraphPad Prism 5.01版（GraphPad软件）进行分析。数据比较采用t检验和单因素分析。p<0.05被认为是具有统计学意义的差异。

2.结果

不同浓度人参皂苷Rg3作用下的细胞活力：

用1、2、4、8和16μg/ml人参皂苷Rg3处理SMMC-7721细胞。如图1所示，在抑制SMMC-7721的细胞活力方面，8μg/ml人参皂苷Rg3更有效。因此，选择8μg/ml人参皂苷Rg3用于以下研究。

图1 不同浓度人参皂苷Rg3作用下的细胞活力

人参皂苷Rg3降低lncRNA HOTAIR表达

通过qRT-PCR，我们检测了lncRNA-HOTAI的相对表达量。图2显示，与对照组相比，人参皂苷Rg3可显著抑制lncRNA-HOTAIR的表达。因此，我们可以认为人参皂苷Rg3可以抑制SMMC-7721细胞和SKHep-1细胞中lncRNA-HOTAIR的表达。

图2 人参皂苷Rg3降低了lncRNA-HOTAIR的表达

人参皂苷Rg3对细胞增殖的抑制作用

用lncRNA-HOTAIR阴性对照质粒、人参皂苷Rg3和lncRNA-HOTAIR过表达质粒处理SMMC-7721细胞和SK-Hep-1细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640(600µl)在37°C/5%CO2下培养48h。采用MTT法检测细胞活力。图3显示，与对照组相比，人参皂苷Rg3组和lncRNA-HOTAIR阴性对照组的SMMC-7721细胞活力显著降低。因此，人参皂苷Rg3可诱导细胞活力下降，从而可能抑制肝癌的发生。

图3 人参皂苷Rg3抑制细胞增殖速率

人参皂苷Rg3抑制细胞的迁移和侵袭能力

与lncRNA-HOTAIR阴性对照质粒、人参皂苷Rg3和lncRNAHOTAIR过表达质粒孵育48h后用划痕法和透孔法评价细胞的迁移和侵袭能力。在图4和图5中，结果显示，与人参皂苷Rg3和lncRNA-HOTAIR过表达组相比，人参皂苷Rg3和lncRNA-HOTAIR阴性对照组的细胞迁移和侵袭能力显著降低。因此，人参皂苷Rg3可能能有效抑制SMMC-7721和SK-Hep-1细胞的迁移和侵袭。

图4 人参皂苷Rg3抑制细胞迁移

图5 人参皂苷Rg3抑制细胞侵袭

人参皂苷Rg3抑制MMP2、MMP9、p-AKT和p-PI3K的表达

对照组、人参皂苷Rg3组、人参皂苷Rg3+lncRNA-HOTAIR过表达组、人参皂苷Rg3+lncRNA-HOTAIR阴性对照组共4个组。在图6中，与对照组相比，人参皂苷Rg3组的MMP2、MMP9、p-AKT和p-PI3K的表达受到显著抑制。此外，用人参皂苷Rg3处理的lncRNA-HOTAIR过表达组的MMP2、MMP9、p-AKT和p-PI3K显著升高。因此，人参皂苷Rg3可诱导SMMC-7721细胞中MMP2、MMP9、p-AKT和p-PI3K的表达降低。

图6 人参皂苷抑制MMP2、MMP9、

p-AKT和p-PI3K的表达

3.结论

我们发现人参皂苷Rg3可显著抑制SMMC-7721和SK-Hep-1细胞的增殖。8μg/ml人参皂苷Rg3下调了lncRNA-HOTAIR的表达，抑制了SMMC-7721和SK-Hep-1细胞的生长和转移，而过表达lncRNA-HOTAIR逆转了人参皂苷Rg3的作用。此外，本研究结果表明，人参皂苷Rg3通过抑制PI3k/AKT信号通路来缓解SMMC-7721和SK-Hep-1细胞的致癌行为。本研究为人参皂苷Rg3的进一步推广和应用奠定了理论基础，并为HCC治疗的研究提供了新的思路。